Journal américain de l'administration de médicaments et de la thérapeutique Libre accès

Abstrait

Expression de l'uréase B de l'Helicobacter pylori iranien dans le tabac Apoplast

Tabrizi Maleki

1. Contexte

Helicobacter pylori est une bactérie Gram-négative, qui a été isolée pour la première fois par Marshall et Warren à partir de la muqueuse gastrique de patients atteints de gastrite et d'ulcères gastroduodénaux. Helicobacter pylori est la principale cause d'infection chronique de la muqueuse gastrique, affectant 50 % de la population mondiale. Récemment, il a été démontré que H. pylori provoquait d'autres complications, telles que des ulcères gastriques, une inflammation duodénale et une gastrite. Selon la littérature, une proportion considérable de patients infectés par H. pylori peuvent ne pas développer de maladies gastroduodénales et peuvent rester asymptomatiques pendant une longue période. D'autre part, les infections à long terme augmentent le risque de maladies telles que l'adénocarcinome et le lymphome gastrique.

Plusieurs études ont confirmé que H. pylori était un agent cancérigène majeur. Le taux de mortalité associé à l'infection par Helicobacter pylori a été estimé à 1 cas pour 34 hommes infectés et 1 cas pour 60 femmes infectées. Helicobacter pylori produit une grande quantité d'uréase (10 à 15 % du poids total des protéines) qui est nécessaire à la survie et à la pathogénèse de H. pylori. De nombreuses enzymes réduisent l'acidité de l'environnement immédiat de H. pylori en produisant de l'ammoniac et du carbonate à partir de l'urée. L'uréase de Helicobacter pylori est une enzyme multimérique d'un poids moléculaire de 550 kDa, qui est recueillie à partir de deux sous-unités distinctes d'UreA (29,5 kDa) et d'UreB (66 kDa). Récemment, les chercheurs se sont intéressés au développement de vaccins contre les infections à H. pylori. Parmi les différents antigènes candidats, l'UreB est considéré comme le plus efficace, car l'immunisation des souris avec l'UreB purifiée entraîne une immunogénicité et une protection supérieures, contrairement à l'urée. Le choix de l'uréase comme cible d'immunisation repose sur le fait que les protéines membranaires provoquent souvent une réponse immunitaire.

Dans cette étude, nous avons utilisé un logiciel de prédiction très performant pour la cartographie des épitopes. Avec plusieurs épitopes spécifiques de lymphocytes B, situés les uns à côté des autres, ce programme a sélectionné le fragment d'acide aminé du gène UreB. De plus, le fragment antigénique a été exprimé et purifié sous forme de protéine recombinante de la souche Escherichia coli BL21(DE3). Cette étude visait à présenter un fragment d'UreB recombinant (rUreB) avec des propriétés antigéniques significatives, en utilisant des logiciels pertinents.

2. Objectifs

L'objectif de cette étude était de fournir un vecteur recombinant, constitué de la région antigénique de l'UreB de H. pylori, en utilisant les épitopes immunodominants de l'antigène au lieu de la séquence totale et de l'expression dans E. coli. Nous avons également cherché à déterminer son antigénicité en tant que candidat vaccin et à évaluer son efficacité dans le diagnostic sérologique de l'infection à H. pylori chez l'homme.

3. Méthodes

3.1. Préparation de bactéries, plasmides et autres réactifs

Dans cette étude, H. pylori a été cultivé à partir de la biopsie de patients dyspeptiques, soumis à une endoscopie diagnostique de routine. Avant la biopsie, le consentement éclairé de tous les patients pour participer à l'étude a été obtenu. Les conditions de culture ont été déterminées sur la base des résultats de rapports précédents. Les échantillons de biopsie isolés ont été cultivés sur gélose Brucella (Merck, Allemagne), contenant du triméthoprime (5 µg/mL), de la vancomycine (10 µg/mL) et de l'amphotéricine B (2,5 µg/mL), complétés par 5 % de sang de mouton.

Après une incubation dans des conditions microaérophiles pendant 3 à 5 jours à 37 °C (CO2 : 10 %), les bactéries cultivées ont été identifiées comme H. pylori via des tests microbiologiques de routine, notamment la coloration de Gram, ainsi que des tests d'oxydase, d'uréase et de catalase. Pour une évaluation plus approfondie, nous avons utilisé les vecteurs pET-32a et pBSK (Novagen Inc., États-Unis). De plus, le vecteur pET-32a a été utilisé pour produire des protéines de fusion avec une étiquette 6-histidine et une étiquette d'épitope T7 N-terminal. Ces acides aminés supplémentaires ont augmenté le poids de la protéine produite jusqu'à 20 kDa. Dans cette étude, les enzymes de restriction et l'ADN ligase ont été achetées auprès de Fermentas (Lituanie), et la souche E. coli DH5α (Stratagene, États-Unis) a été utilisée pour le clonage initial. De plus, le pET-32a recombinant (pET-32a UreB) a été transformé dans E. coli BL21(DE3)pLysS (Novagen, USA) comme souche hôte de bactéries. Pour la culture bactérienne de routine, nous avons utilisé le bouillon de lysogénie (bouillon Luria-Bertani, LB ; Sigma, USA). Les antibiotiques requis, dont l'ampicilline (100 µg/mL) et le chloramphénicol (34 µg/mL ; Sigma, USA), ont été ajoutés au milieu LB (10). Les produits chimiques ont été achetés auprès de Merck (Allemagne) et les enzymes ont été obtenues auprès de Fermentas (Lituanie) et de SinaClon Co.

Résultats : Les résultats du séquençage de la PCR ont indiqué le clonage du gène UreB dans le plasmide recombinant. La production de la protéine a été induite par l'isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG) et la protéine exprimée a été purifiée par dialyse, en utilisant le kit Ni-NTA. De plus, la protéine recombinante d'un poids moléculaire de 42 kDa a été reconnue par des anticorps lors du Western blot.

Conclusion : L'évaluation des anticorps a révélé des propriétés antigéniques élevées pour le fragment immunogène, prédites par bioinformatique immunologique. Par conséquent, la protéine recombinante UreB pourrait être un antigène approprié pour le développement de vaccins contre H. pylori et d'autres kits de diagnostic.