Journal du VIH et du virus rétro Libre accès

Abstrait

Création d'un clone d'ADNc virulent de pleine longueur pour le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV)

Zhu Longchao

Le clone infectieux du MERS-CoV est une plate-forme importante pour l'étude de la fonction protéique du virus et de l'interaction virus-hôte. Dans la présente étude, le clone d'ADNc infectieux du MERS-CoV adapté aux cellules Vero (MERS-CoV-HKU) a été généré avec une technologie de clonage sans couture basée sur le site de restriction de classe II BsmBI. Son génome a été divisé en un panel de 12 fragments contigus et, après amplification par PCR, flanqué de BsmBI. Les fragments ont ensuite été assemblés en chromosomes artificiels bactériens (BAC) à l'aide de jonctions uniques formées par digestion de l'endonucléase BsmBI avec deux cycles de clonage. Deux sites de restriction BsmBI à l'intérieur du génome ont été supprimés par mutation silencieuse et définis comme marqueur moléculaire de l'icMERS-CoV-HKU. Enfin, une longueur complète de MERS-CoV-HKU, en aval du promoteur CMV dans BAC, a été récupérée.

En comparaison avec la souche sauvage HCoV-EMC/2012, le MERS-CoV-HKU récupéré par clone infectieux a montré des titres élevés sur les cellules Vero et Huh7. Par analyse génétique, une modification génétique a été trouvée sur les protéines non structurelles (nsp2, nsp3, nsp14 et nsp16) et les protéines structurelles (Spike, ORF5 et N). Les mutations synonymes ont été placées dans nsp2 (A2169C), nsp3 (C6172T, A6954G), nsp14 (C19514T), nsp16 (T21423G), S (A22367G, T24093A) et N(T29149A). Des mutations non synonymes ont été trouvées dans nsp3 (C6172T, A6954G), S (C25217T) et N (A29574T), ce qui conduit à une mutation des acides aminés dans nsp3 (T198I, D1702Y), S (S1251F) et N (S192T). De manière surprenante, une insertion de trois acides aminés « SHY » et une délétion de quatre nucléotides « TTTA » ont été trouvées respectivement dans les régions S2 et ORF5.

Selon l'étude précédente, le RBD de BatCoV-HKU4 et BatCoV-HKU25 peut reconnaître le récepteur DPP4 humain, mais pas le RBD de BatCoV-HKU5. Pour élucider la relation entre le MERS-CoV et les BatCoV, le clone infectieux du MERS-CoV et les clones infectieux chimériques du MERS-CoV ont été générés dans lesquels la région RBD du MERS a été remplacée par celle de BatCoV-HKU4, BatCoV-HKU5 et BatCoV-HKU25. Les clones infectieux recombinants du MERS-CoV ont été évalués plus en détail pour leur réplication sur les lignées cellulaires Vero et Huh7.

Notre clone infectieux recombinant MERS-CoV a démontré son rôle crucial dans l’étude de la transmission interspécifique et de la pathogenèse du coronavirus.