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Abstrait

L'anticorps anti-MyoD diminue le phénomène organique de la myogénine et l'agrégation des récepteurs du neurotransmetteur induit par l'agrine

 Erica E Anderson1, David H Campbell2, Kelly Ezell1, Paul R Standley2 et Wade A Grow1

Une famille de facteurs restrictifs myogéniques, ainsi que MyoD et la myogénine, guident la myogenèse et la formation de la jonction contractante. Le phénomène organique de la myogénine est activé par MyoD, et l'une des fonctions de la myogénine est d'activer le phénomène organique du récepteur du neurotransmetteur (AChR) à la jonction contractante. Les motoneurones libèrent de l'agrine lorsqu'ils se rapprochent des fibres musculaires en développement, ce qui entraîne l'agrégation d'AChR existants vers le positionnement de la formation de la jonction contractante. Nous avons précédemment démontré qu'une exposition continue de la protéine à MyoD ou à la myogénine diminue l'agrégation d'AChR induite par l'agrine dans la culture de cellules musculaires C2C12. Notre objectif était d'établir plus précisément comment MyoD et la myogénine se déplacent au cours du développement. Méthodes : Les cultures de cellules C2C12 ont été exposées à des manipulations expérimentales ainsi qu'à des anticorps contre MyoD et la myogénine, et à la morpholino de la myogénine. L'Endo-Porter a été utilisé pour améliorer l'absorption cellulaire des manipulations expérimentales. Des tests d'agrégation d'AChR ont été effectués pour évaluer l'impact des protéines ou de la morpholino sur l'agrégation d'AChR induite par l'agrine. Les Western blots accèdent au phénomène organique de la myogénine lors de l'exposition aux protéines ou à la morpholino. Résultats : Les résultats obtenus ici démontrent qu'une exposition aussi courte que huit heures de la protéine à la myogénine diminuera l'agrégation d'AChR induite par l'agrine dans les myotubes. Nous avons déjà prouvé que certaines manipulations expérimentales réduisent le phénomène organique de la myogénine simultanément à une diminution de l'agrégation d'AChR induite par l'agrine. Ces résultats établissent de manière plus spécifique comment MyoD et la myogénine interviennent dans la formation de jonctions contractantes en démontrant que l'exposition de la protéine à MyoD réduit le phénomène organique de la myogénine simultanément à une diminution de l'agrégation d'AChR induite par l'agrine. Conclusion : Ces résultats suggèrent que MyoD est crucial pour l'agrégation d'AChR induite par l'agrine par un mécanisme qui comprend l'activation du phénomène organique de myogénine, entraînant l'activation du phénomène organique d'AChR, puis la production d'un niveau approprié d'AChR pour l'agrégation d'AChR induite par l'agrine et la formation de jonctions contractantes. Les AChR ont été marqués par la liaison de l'α-bungarotoxine conjuguée à la tétraméthylrhodamine (Molecular Probes). Les cultures ont été incubées dans le milieu contenant la toxine pendant 30 minutes à 37° C pour marquer les AChR après 72 heures dans le DM. Les couvre-lits ont été rincés trois fois avec du tampon salin au phosphate (PBS) à température ambiante, fixés pendant dix minutes avec une solution de paraformaldéhyde dans du PBS, rincés trois fois avec du PBS, déshydratés dans de l'alcool de bois froid pendant cinq minutes à -20°C et montés sur des lames de loupe dans du milieu de montage Vectashield pour la lumière visible (Vector Laboratories). Les clusters AChR ont été visualisés avec une loupe inversée Olimbos IX70 sous l'objectif 20X (donnant un grossissement complet de 200X). Les images fluorescentes ont été capturées sous forme de fichiers JPG haute résolution avec un appareil photo Olimbos avec un package d'imagerie numérique Magnafire.Des amas lumineux d'AChR ont été découverts sur tous les côtés des myotubes dans les images fluorescentes. Chaque image en niveaux de gris a été analysée à l'aide de la formule d'identification d'objet de Cell Profiler. Le seuil utilisé dans la formule a été défini comme l'intensité fluorescente minimale qu'un pel doit afficher pour être compté comme faisant partie d'un cluster. L'expérimentation avec le seuil a révélé qu'une luminosité minimale de 70 % définissait au mieux un pel avec suffisamment de lumière visible pour être compté comme faisant partie d'un cluster, et ce seuil a été utilisé pour toutes les analyses. Pour garantir un jugement sûr et une quantification cohérente, le seuil et tous les paramètres alternatifs étaient constants sur tous les groupes et images. Les modèles d'activation de séquence au cours de la myogenèse prédisent que les gènes sont activés consécutivement à l'activation de la myogénine par MyoD. Le plan initial de différenciation myogénique a combiné la liaison des facteurs de transcription à l'échelle du génome et l'identification de l'expression pour mieux élucider le processus de différenciation myogénique dans les cellules musculaires de classe. Les facteurs restrictifs myogéniques dirigent la myogenèse ainsi que l'assemblage de la jonction contractante. Plus précisément, le plan initial incontestable selon lequel, lors de la croissance des myoblastes, MyoD ciblait les gènes impliqués dans la spécification et le contractant des jonctions.
Mots clés : AChR ; Agrine, C2C12 ; expression de séquence ; MyoD ; Myogénine ; jonction contractante.